牦牛源正呼肠孤病毒2型的检测和分离鉴定

旨在调查川西北牦牛哺乳动物正呼肠孤病毒（MRV）的感染情况并分离病毒。采用RT-PCR方法，对采自川西北15个牧场的72份牦牛腹泻粪便样本和其中5个牧场的15份腹泻牦牛血清样本进行MRV检测，阳性样本进一步用分型PCR确定其血清型。结果显示，粪便样本中MRV检出率为20.83%（15/72），血清2型的比例为60%（9/15）；血清样本中MRV检出率为40%（6/15），血清2型的比例为83.33%（5/6）；未检测到其他血清型。成功地从腹泻粪便中分离到1株MRV血清2型毒株（TCID₅₀为4×10^-8.56·mL^-1），并获得长度为23 587 bp的分离株全基因组，该分离株与中国猪源毒株的遗传关系最近；与GenBank中所有的MRV S1基因相比，该分离株有4个独特的氨基酸突变。本研究从牦牛中检测到MRV，并分离到1株牛源MRV血清2型毒株，为进一步研究MRV血清2型生物学特性奠定了基础。     

草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA提取方法的研究

基于传统的酸性酚—异硫氰酸胍—氯仿一步提取法,比较分析多种优化操作步骤,摸索出一种高质量提取体质量为80~150 g草鱼肠系膜脂肪组织总RNA的改良方法。试验结果显示,相较于肝脏、脾脏、肠道等脏器组织,草鱼肠系膜脂肪组织RNA丰度低,且极易在样品前处理阶段出现顽固性降解问题。探索发现,将取样量增至约30 mg,可提升RNA产量以满足常规试验需求。针对降解难题,改良常规的样品前处理技术流程,采用鲜样液氮速冻,冻样直接放入TRIzol试剂中裂解,并即刻进行长时间机械匀浆,时长约3 min等核心操作步骤,可显著降低脂肪组织样品RNA的降解。Agilent生物分析仪检测结果显示,改良方法提取的草鱼肠系膜脂肪组织RNA完整度高,关键RIN值为8.7~9.0。研究推测,长时间机械匀浆所形成的持续剪切冲击力或许有助于TRIzol试剂中的异硫氰酸胍等成分突破油滴阻碍而有效抑制内源性RNA酶。本方法提取的草鱼脂肪组织总RNA质量可满足高通量转录组测序要求。     

2株毒死蜱降解菌的分离鉴定及其混合降解特性研究

从生产毒死蜱农药厂采集的活性污泥中分离筛选得到2株降解效率较高的毒死蜱降解菌,命名为D1、D3,根据表型特征、生理生化特性和16 S rRNA基因序列相似性分析,将其鉴定为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)和副球菌属(Paracoccus sp.)细菌。2株菌以最佳配比(1∶1.25)混合施用时,与单菌相比,毒死蜱降解效率可提高12%~26%;以混合菌株为研究对象,发现其对毒死蜱最适降解温度为30℃,最适降解pH值为7.0,最适NaCl浓度为0.5%;混合菌株施入土壤后,可保持较高的定殖能力和降解效率。     

Identification,characterization and full-length sequence analysis of a novel endornavirus in common sunflower (Helianthus annuus L.)

To identify the possible quarantine viruses in seven common sunflower varieties imported from the United States of America and the Netherlands, we tested total RNAs extracted from the leaf tissues using next-generation sequencing of small RNAs. After analysis of small RNA sequencing data, no any quarantine virus was found, but a double-stranded RNA(dsRNA) molecule showing typical genomic features of endornavirus was detected in two varieties, X3939 and SH1108. Full-length sequence and phylogenetic analysis showed that it is a novel endornavirus, temporarily named as Helianthus annuus alphaendornavirus(HaEV). Its full genome corresponds to a 14 662-bp dsRNA segment, including a 21-nt 5′ untranslated region(UTR), 3' UTR ending with the unique sequence CCCCCCCC and lacking a poly(A) tail. An open reading frame(ORF) that encodes a deduced 4 867 amino acids(aa) polyprotein with three domains: RdRP, Hel and UGT(UDP-glycosyltransferase). HaEV mainly distributed in the cytoplasm but less in the nucleus of leaf cells by fluorescence in situ hybridization(FISH) experiment. This virus has a high seed infection rate in the five varieties, X3907, X3939, A231, SH1108 and SR1320. To our knowledge, this is the first report about the virus of the family Endornaviridae in the common sunflower.     

安徽省猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其主要毒力基因分子特征

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性、热性传染病。自2011年底以来,PRV发生了变异,传统的PRV弱毒疫苗已不能对PRV变异株提供完全保护,这给我国PR防控带来了巨大挑战。为了解安徽省PRV流行特征及其主要毒力基因遗传变异情况。利用PCR技术、细胞接种试验、电子显微镜观察、间接免疫荧光试验及兔体接种试验等方法,对安徽省临诊病例中疑似PRV感染的病猪进行病原检测及PRV分离鉴定,并通过设计6对特异性引物对PRV分离株主要毒力基因(gE、gI、TK、gB、gC、gD)进行克隆及测序分析。2016—2018年安徽省临诊病例中共分离鉴定15株PRV;PRV分离株主要毒力基因序列均与2011年后国内PRV变异株同源性较高;与2011年前国内PRV经典株序列比对,PRV分离株gE、gB、gC及gD基因存在多个位点的一致性替换、插入或缺失,且gE、gC基因多位点突变位于其重要的抗原表位区。本研究分离的15株PRV均为变异株,变异株已成为安徽省主要的流行毒株。15株PRV分离株的gI、TK基因序列较为保守,而gE、gC蛋白抗原表位区域氨基酸的突变可能导致其毒力及抗原性发生改变。部分PRV分离株与邻近地区PRV序列同源性均为100%,可能与频繁跨省调运生猪、跨区引种等原因有关。     

鸡流行性腹泻病原的分离鉴定及特性研究

用胰蛋白酶处理发病鸡的粪便和肠内容物，接种Marc145细胞，盲传数代后，从山东不同地区发生流行性腹泻的鸡群中分离到轮状病毒，并对分离的轮状病毒的生物学特性和理化特性进行了部分研究。结果表明病毒粒子的形态呈车轮状、大小为70-80nm；其病毒基因组的电泳图谱为5：1：3：2；病毒在Marc145细胞上传到第9代时的TCID50为10^-4.62／0．1mL；该分离株病毒对氯仿、乙醚有抵抗力；对pH3．0处理60min稳定；50℃ 30min能使其感染力下降10^2；1mol／L MgCl2不能增强其对50℃ 60min的抵抗力。动物回归试验中接种两周龄SPF鸡，24h后陆续发病，表现为持续性水样腹泻，与自然发病相同；剖检可见病鸡脱水、小肠内有大量的液体和气泡、肠粘膜变薄；组织学变化为肠绒毛上皮坏死、脱落，绒毛平均长度减少而隐窝深度增加，固有层中淋巴细胞浸润。其临床症状及病理组织学变化与自然发病相同。因此确定发生在山东鸡流行件腹泻的病原为轮状病毒．     

捕食线虫性真菌的分离培养及分布规律

对自然界中的捕食线虫性真菌进行了分离和种属区分，并对分布规律进行了研究。从土壤、粪便等材料中获得了2类活性较强的捕食线虫性菌株：即套捕型(hooping)捕食线虫性真菌和粘捕型(sticking)捕食线虫性真菌。主要的代表种类有3种。这些捕食线虫性真菌在捕食性结构分生孢子形态及某些生物学特性上有一定差异。套捕型捕食线虫性真菌代表种为少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospara)和梨形指环菌(Dactylaria pyriformis)，它们以菌环、菌网作为捕食性结构(器官)，以套捕方式杀灭线虫幼虫。梨形指环菌可产生多量厚垣孢子(chlamyalospore)。粘捕型捕食线虫性真菌代表种为纺锤隔指孢菌(Dactylella ellipsospora)。可形成菌结捕食线虫性结构，以粘捕的方式杀灭线虫幼虫。结果表明：捕食线虫性真菌在土壤和家畜粪便中的分离率是40．41％；此类菌适合于生存在阴暗、潮湿、富含腐植质的环境中。在温暖季节时，采用0．4g／L玉米粉琼脂培养基(CMA)易于对其进行分离培养。     

从腹泻金黄地鼠中分离出致病性大肠杆菌

从腹泻金黄地鼠中分离到 3株细菌 ,经染色镜检、生化反应鉴定和动物试验确证 :该菌为大肠杆菌。该试验为地鼠大肠杆菌的防制提供了流行病学资料与理论依据。     

猎豹与虎猫杯状病毒的分离及其超变区基因比较研究

用F81细胞从上海某动物园患口腔溃疡的猎豹和虎的唾液病料中分离获得两株杯状病毒，经形态学、理化学、生物学鉴定和病毒核酸超变区基因RT-PCR扩增与序列测定证明两株病毒均为猫杯状病毒(FCV)，分别命名为FCV/cheetah/Shanghai/02/2002与FCV／tiger/Shanghai／03/2002。人工感染猫可引起体温升高，口腔溃疡，食欲下降等症状。两株病毒的超变区序列520bp长片段问的同源性为99.2％，与国内桂林虎分离株(TFCV9710)的同源性为74．0％，与国外分离株的总体同源性为58．1％，说明不同宿主或同种不同个体间杯状病毒分离株超变区核酸差异十分显著，符合猫杯状病毒的分子生物学特征。